Recent breakthroughs in the study of salicylic acid biosynthesis
Jean –pierre
Salicylic acid is an important regulator of induced plant resistance to pathogens.
Consequently,the biosynthesis of salicylic acid and its regulation has received a lot of ametrauxttention.salicylic acid can be made from phenylalanine via cinnamic and benzoic acid.Recently ,genetic studies in Arabidopsis have shown that salicylic acid is made in the chloroplast from isochorismate , a pathway that is known to operate in prokaryotes.
Salicylic acid is common throughout the plant kingdom and is known as a regulator for physiological processes such as thermogenesis or plant defense against harmful microorganisms.recognition of the pathogen by elicitors released at the site of infection is rapidly followed by changes in ion fluxes and production of reactive oxygen species that start a signaling cascade leading to the activation of transcription factors involved in the activation of defense genes. Such genes function in the synthesis of regulators such as salicylic acid or ethylene,cell wall strengthening,production of antibiotic metabolites or in the development of a hypersensitive reaction.these processes lead to local acquired resistance(LAR)in the infected cells and immediate surroundings[1].defense reactions are also deployed at a distance from the initial infection site,leading to systemic acquired resistance (SAR)[2].matants or transgenic plants impaired in the accumulation of salicylic acid cannot mount efficient defense responses to pathogens after infection,demonstrating the importance of salicylic acid for LAR and SAR[2].
Classical biochemical approaches
The importance of salicylic acid as a signal for disease resistance has stimulated considerable interest in its biosynthesis.In higher plants, it is well established that salicylic acid derives from the shikimate-phenylpropanoid pathway[2].Two routes from phenylalanine to salicylic acid have been described that differ at the step involving hydroxylation of the aromatic ring.phenylalanine is converted into cinnamic acid by phenylalanine ammonia lyase.cinnamic acid can be hydroxylated to form ortho-coumaric acid followed by oxidation of the side chain.Alternatively,the side chain of cinnamic acid is initially oxidized to give benzoic acid, which is then hydroxylated in the ortho position[2].In tobacco,salicylic acid was first proposed to be synthesized from free benzoic acid,but later results indicated that benzoyl glucose ,a conjugated form of benzoic acid,is more likely to be the direct precursor of salicylic acid[3,4].cinnamic acid-derived synthesis of salicylic acid also takes place in cucumber,potato and rice[2].Although all these studies point towards a biosynthetic pathway from phenylalanine via cinnamic acid and benzoic acid,the exclusive role of this route in pathogen-induced salicylic acid synthesis was never fully assessed.
Genetic approaches
Arabidopsis thaliana produces salicylic acid locally and systemically after pathogen infection and develops salicylic acid-dependent SAR [5].various mutants impaired in salicylic acid accumulation after pathogen infection have been described[6-8].Such mutants have a higher susceptibility to fungal or bacterial pathogens and cannot induce pathogenesis-related protein PR1,a marker of salicylic acid-induced SAR.
Mary wildermuth and colleagues recently an importantbreakthrough in the understanding of salicylic acid biosynthesis. They havemapped the salicylic acid-induction-deficient sid2mutation to a gene (ICS1)encoding isochorismate synthase [9].the ICS1 gene includes the highly conserved chorismate-binding domain and shares 57% amino acid sequence identity with catharanthus roseus ICS and 21% identity with bacterial ICS,both of which have confirmed biochemical activities [10,11].ICS1 is induced locally and systemically upon pathogen infection.the level of salicylic acid after infection in sid2 mutamts is only 5-10% of the wild-type levels and resistance to fungal or bacterial pathogens is reduced [6,9].this provides strong evidence that salicylic acid produced by ICS1 is required for SAR.besides the strong homology with catharanthus ICS,ESTs for ICS have been annotated in soybean and wild tomato[9],making it likely that higher plants produce pathogen-induced salisylic acid from isochorismate,a bioswynthetic pathway typical for bacteria. The presence of a plastid transit peptide and cleavage site in the ICS1 gene indicates plastid localized synthesis of salicylic acid and provides support for the idea that the salicylic acid pathway in Arabidopsis might derive evolutionarily from prokaryotic endosymbionts[9]. An examination of the ICS1 promoter shows the presence of W-box elements. Such elements are recognized by various WRKY transcription factors that are generally involved in the regulation of pathogen or stress responses[12]. The ICS1 promoter also contains a binding site for Myb transcription factors reported to regulate genes for plant defense and associated secondary metabolism [13,14]. Interestingly, the promoter of ICS1 contains neither bZip nor NF-KB motifs that are typically required for the induction of PR1 by salicylic acid [15,16]. Indeed, ICS1 expression must be independent of salicylic acid because normal expression levels are observed in the salicylic acid-degrading NahG plants [9]. Thus,the control of ICS1 expression,salicylic acid and subsequent defense responses are likely to depend on another (earlier) signal than salicylic acid. The plastid localization of ICS1 and salicylic acid synthesis raises the problem of transporting salicylic acid from the plastids to its presumed site of action in the cytoplasm. Interestingly, christiane nawrath and colleagues described the mapping of another sid mutant, eds5/sid1,as a membrane protein [17]. EDS5/SID1 is homologous to the bacterial multidrug and toxin extrusion proteins (MATE) [18] that have recently been reported to occur in Arabidopsis [19,20].preliminary analysis by Nawrath et al. (unpublished) indicates that EDS5/SID1 is localized at the chloroplast. It would be interesting to learn more about the nature of the substrate (s) transported by EDS5/SID1. The expression of EDS5/SID1 and SID2 [9,17] in mutants constitutively expressing high levels of salicylic acid (such as cpr mutants) or involved in the regulation of SAR (such as eds1 , pad4,ndr 1 and nim1/npr1) locates ICS1 in the signal transduction pathway for salicylic acid-dependent SAR.
Conclusions
The role and relevance of cinnamic acid-derived salicylic acid in LAR and SAR needs to bere-evaluated in the light of pathogen-induced salicylic acid synthesized from isochorismate.The importance of the isochorismate pathway might not be unique to Arabidopsis because ICS occurs in plants belonging to diverse families[9].If the cinnamic acid and the isochorismate pathways operate in a same species, each pathway might be induced by specific stimuli.Results obtained with the Arabidopsissid2 mutant donot support this view because salicylic acid accumulation is blocked after distinct stimuli,such as virulent or a virulent pathogens,ozone stress or callus formation [6].Alternatively,the cinnamic acid pathway might only contribute to basal levels of Salicylic acid present in uninfected plants. Besides cinnamic acid, another source of the basal levels of salicylic acid was proposed to result from the action of a second ICS gene (ICS2);the transcripts of which remain undetected in infected in or uninfected leaves of Arabidopsis[9].several reports based mainly on radiolabeling and inhibitor studies provided evidence for pathogen-induced increases in cinnamic acid-derived salicylic acid [2]. The specific contribution of cinnamic acid-derived salicylic acid for the setting up of SAR presently escapes our understanding because the evidence obtained in arabidopsis demonstrates that the balk of salicylic acid is produced from ICS [9]. More experiments are needed to clarify the function and regulation of cinnamic acid-and isochorismate-derived salicylic acid.
In summary,these highlights on salicylic acid biosynthesis provide promising new tools for an understanding of the molecular basis of the regulation of salicylic acid biosynthesis.
Acknowledgements
The financial support of the Swiss national science foundation(grant 31-55662.98)isgratefully acknowledged. I thank antony buchala and christiane nawrath for comments on the manuscript.
References
1. Dangl, J .L. and jones,J.D.G.(2001)Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature 411,826-833
2. Sticher,L.et al.(1997) Systemic acquired resistance. Annu.Rev. plant pathol.35,235-270
3. Yalpani,N.et al.(1993)Pathway of salicylic acid biosynthesis in healthy and virus-inoculated tobacco.plant Physiol.103,315-321
4. Chong,G.et al.(2001) free and conjugated benzoic acid e tobacco plants and cell cultures. Anduced accumulation upon elicitation of defense response and role as salicylic acid precursors.plant Physiol. 125, 318-328
5. summermatter, K.et al. (1995) Systemic responses in Arabidopsis thaliana infected and challenged with Pseudomonas syringae.pv syringae. Plant physiol. 108, 1379-1385
6. Nawrath, C. and metraux, J .P. (1999) Salicylic acid induction-deficient mutants of Arabidopsis express PR-2 and PR-5 and accumulate high levels of camalexin after pathogen inoculation. Plant cell 11, 1393- 1404
7. Dewdney , J. et al. (2000) Three unique mutants of Arabidopsis identify eds loci required for limiting growth of a biotrophic funjal pathogen. Plant J. 24, 205-218
8. Dong, X. (2001) Genetic dissection of systemic acquired resistancn. Cura. Plant Biol. 4, 309-314
9. Wildermuth, M. C. et al. (2001) Isochorismate synthase is required to synthesize salicylic acid for plant defence. Nature 414, 562-565
10. Van tegelen, L. J .P. et al. (1999) Purification and cDNA cloning of isochorismate synthase from elicited cell cultures of catharanthus roseus. Plant physiol. 119, 705-712
11. serino, L. et al. (1995) Structural genes for salicylate biosynthesis from chorismate in pseudomonas aeruginosa. Mol. Gen. genet. 249, 217-228
12. Eulgem, T. et al. (2000) The WRKY superfamily of plant transcription factors. Trends plant Sci. 5, 199-206
13. Yang, Y. O. and klessig, D.F . (1996) Isolation and characterization of a tobacco mosaic virus- inducible Myb oncogene homolog from tobacco proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 93, 14972-14977
14. Bender, J. and Fink, G. R. (1998) A Myb homologus,ATR1, activates tryptophan gene expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 95, 5655-5660
15. Ryals, J. et al. (1997) the Arabidopsis NIM1 protein shows homology to the mammalian transcription factor inhibitor IKB. Plant cell 9, 425-439
16. Cao, H. et al. (1997) The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cell 88, 57-63
17. Nawrath, C. et al. (2002) EDS5 an essential component of SA-dependent signaling for disease resistance in Arabidopsis, is a member of the MATE-transporter family. Plant cell 14, 275-286
18. Brown, M.H. et al. (1999) The multidrug efflux protein NorM is a prototype of new family of transporters. Mol. Microbiol. 31,394-395
19. Debeaujon, I. et al. (2001) The TRANSPARENTTESTA 12 gene of Arabidopsis encodes a multidrug secondary transporter-like protein required for flavonoid sequestration in vacuoles of the seed coat endothelium. Plant cell 13, 853-871
20. Diener,A.C. et al. (2001) Arabidopsis ALF5, a multidrug efflux transporter gene family member, confers resistance to toxins. Plant cell 13, 1625-1638
پیشرفت های اخیر در مطالعه ی بیوسنتز (تولید زیستی) اسید سالیسیلیک
اسید سالیسیلیک، تنظیم کننده ی مهمی در ایجاد مقاومت گیاه به عوامل بیماری زا است. بنابراین بیوسنتز (ساخت زیستی) و تنظیم آن مورد توجه بسیار قرار گرفته است. اسید سالیسیلیک می تواند با کاربرد اسید سینامیک و بنزوئیک، از فنیل الانین ساخته شود. اخیراً مطالعات ژنتیکی بر روی گیاه Arabidopsis نشان داده است که اسید سالیسیلیک در کلروپلاست، در مسیر isochorismate ، مسیری که در پروکاریوت ها فعال است، ساخته می شود.
اسید سالیسیلیک در سلسله ی گیاهان شناخته شده می باشد و از آن به عنوان تنظیم کننده ی فرآیندی فیزیولوژیکی مانند گرمازایی یا دفاع گیاه در برابر میکرو ارگانیسم های زیانبار یاد می شود. تشخیص عامل بیماری زا با استفاده از مواد آزاد شده در محل آلودگی، بلافاصله با تغییر جریان یونی و تولید انواع فعال کننده های اکسیژن دنبال می شود که به نوبه ی خود یک جریان پیام رسانی را برای فعال سازی عوامل رونویسی موجود در فعال سازی ژن های دفاعی آغاز می کند. این ژن ها در تولید تنطیم کننده هایی مانند اسید سالیسیلیک یا اتیلن، تقویت دیواره سلولی، تولید متابولیت های آنتی بیوتیکی (ضد زیستی) و یا در پیشرفت یک واکنش بسیار حساس عمل می کنند. این فرآیند ها به ایجاد مقاومت اکتسابی محلی(LAR) در سلول های آلوده و مجاور آن ها می انجامد [1].
همچنین واکنش های تدافعی در فواصل دیگر از محل آلودگی اولیه به وجود می آید که به مقاومت اکتسابی سیستمیک (SAR) منجر می شود. [2]. گیاهان جهش یافته یا ترا ریخته ای که در تجمع اسید سالیسیلیک دچار نقص اند، نمی توانند پس از آلودگی، در برابر عوامل بیماری زا به طور مؤثری واکنش تدافعی نشان دهند، که این امر اهمیت اسید سالیسلیک را در LAR و SAR نشان می دهد.
دستاوردهای بیوشیمیایی سنتی
اهمیت اسید سالیسیلیک به عنوان پیامی برای مقاومت به بیماری، توجهات قابل ملاحظه ای را به سوی بیوسنتز آن جلب کرده است. در گیاهان عالی تر، به خوبی مشخص شده است که اسید سالسیلیک از مسیر بیوشیمیایی شیکیمات- فنول پرویانوید به دست می آید [2].
برای اسید سالسلیک دو مسیر از نوع فنیل آلانین توصیف شده است که در مرحله ی هیدروکسیل دار شدن حلقه های آروماتیک با هم متفاوتند.
فنیل آلانین یا آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز به سینامید تبدیل می شود. اسید سینامیک می توانید با هیدروکسیله شدن و در پی آن با اکسید شدن زنجیزه ی کناری اش، به اسید اورتوکومارین تبدیل شود.
از سوی دیگر، زنجیره های جانبی اسید سینامیک می تواند اکسید شده و اسید بنزوئیک تولید کند، که سپس در موقعیت اورتوهیدروکسیله می شود [2].
در ابتدا تصور می شد که در تنباکو اسید سالیسیلیک از اسید بنزوئیک آزاد تولید می شود، اما بعد ها نتایج نشان داد که بنزیل گلوکز، که شکل دو گانه ی اسید بنزوئیک است، گزینه ی محتمل تری برای آن است که فرم اولیه ی اسید سالیسلیک باشد [3و4]. ساخت اسید سالیسیلیک از اسید سینامیک، در خیار، سیب زمینی و برنج نیز وجود دارد [2].
اگر چه تمام این مطالعات به مسیر بیوسنتزی تولید اسید سالیسیلیک از فنیل آلانین با استفاده از اسید سینامیک و اسید بنزوئیک اشاره می کنند، اما نقش اختصاصی این مسیر در ساخت اسید سالیسیلیک ناشی از تحریک عوامل بیماری زا هیچگاه به طور کامل بررسی نشده است.
دستاوردهای ژنتیکی
گیاه Arabidopsis thaliana پس از آلودگی توسط عوامل بیماری زا، به صورت محلی و سیستمیک اسید سالیسیلیک تولید می کند و SAR وابسته یه اسید سالیسیلیک را توسعه می دهد [5].
جهش یافته های مختلفی که پس از آلودگی به عوامل بیماری زا در تجمع اسید سالیسیلیک دچار اختلال هستند توصیف شده اند .[6و8].
این جهش یافته ها تحمل و سازگاری بیشتری به عوامل بیماری زای قارچی یا باکتریایی داشته و نمی توانند پروتئین PR1 مرتبط با پاتوژن ها را که نشان گر SAR حاصل از اسید سالیسیلیک است، تحریک کنند.
اخیراً Mary Wildermath و همکاران پیشرفت مهمی را در درک سنتز اسید سالیسیلیک گزارش کرده اند. آنها، جهش نقص تحریک اسید سالیسیلیک Sid2 را به یک ژن ICS1) ) که ساخت ایزوکوریسمات را کد گذاری می کند نسبت می دهند.[9]. ژن ICS1 دامنه ی پیوندی کوریسماتی بسیار حفاظت شده ای را داراست و 57% توالی اسید آمینه همسان با Catharanthus roseus ICS و 21% همسانی با ICS باکتریایی را به اشتراک می گذارد، که هردو فعالیت های بیوشیمیایی را تأیید می کنند[10و11]
ژن ICS1 دراثر آلودگی به عوامل بیماری زا، به صورت موضعی و سیستماتیک تحریک می شود.
درجهش یافته های sid2 پس از آلودگی، سطح اسید سالیسیلیک تنها 10- 5% گونه های وحشی بوده و مقاومت به عوامل بیماری زای قارچی یا باکتریایی در آن ها کاهش یافته است.[6و9].
این موضوع شواهد قوی را به دست می دهد که نشان می دهد اسید سالیسیلیک تولید شده توسط ژن ICS1 برای SAR مورد نیاز است. گذشته از همسانی زیاد با ژن ICS Catharanthus ، EST ها برای ICS در سویا و گوجه فرنگی وحشی نیز تشریح شده است.[9]، که این احتمال را مطرح می کند که گیاهان عالی تر اسید سالیسیلیک تحریک شده توسط عوامل بیماری زا را از Isochorismate ، که نوعاً مسیر بیوسنتزی باکتری است، تولید می کنند.[شکل 1].
وجود یک پیتید عبوری پلاستیدی و محل گسستگی در ژن ICS1 ، ساخت پلاستیدی اسید سالیسیلیک را نشان می دهد و از این ایده پشتیبانی می کند که ممکن است مسیر تولید اسید سالیسیلیک در Arabidopsis به طور تکاملی از همزیست های داخلی پروکاریوتی ایجاد شده باشد. آزمایش پروموتورهای (راه اندازهای) ICS1 حضور عناصر W- box را نشان می دهد. این عناصر توسط عوامل مختلف نسخه برداری که عموماً در تنظیم واکنش های پاتوژنی یا تنش ها نقش دارند، شناسایی شده اند.[12].
همچنین پروموتور (راه انداز) ICS1 دارای یک محل برای پیوند با عوامل نسخه برداری Myb می باشد که گزارش شده است ژن های مؤثر در سیستم دفاعی گیاه و متابولیسم ثانویه مرتبط با آن را تنظیم می کند.[13و14].
شگفت است که پروموتورهای ICS1 فاقد موتیف های bZip یا NF-xB می باشد که نوعاً برای تحریک PRI توسط اسید سالیسیلیک ضروری می باشند.[15و16]. در واقع، بیان ICS1 باید مستقل از اسید سالیسیلیک باشد، زیرا سطوح طبیعی بیان آن درگیاهان NahG تجزیه کننده ی اسید سالیسیلیک مشاهده شده است [9]. بنابراین، کنترل بیان ژن ICS1، اسید سالیسیلیک، و واکنش های تدافعی مربوط به آن حتماً به پیام دیگری (زودتر) در مقایسه با اسید سالیسیلیک وابسته اند.
استقرار ICS1 در پلاستید و ساخت اسید سالیسیلیک مشکل انتقال اسید سالیسیلیک را به وجود آورد چرا که باید از محل پلاستید به محل مصرف و عمل خود در سیتوپلاسم انتقال یابد. کریستین ناورات و همکاران، یک جهش یافته ی Sid دیگر (eds5 / sid1) را به عنوان پروتئین غشایی مورد شرح قرار دادند [17].
EDS5-SID1 همسان (همولوگ) پروتئین های چند دارویی و دفع سم باکتریایی [18].
(MATE) است که اخیراً وجود آن در Arahidopsis تأیید شده است[19و20].
تجزیه و تحلیل های اولیه که توسط Nawrath و همکاران (منتشر نشده) انجام شد، نشان داد که EDS5 – SID1در کلروپلاست قرار دارد. جالب خواهد بود که بیشتر در مورد سوبستراهای انتقال یافته توسط EDS5 – SID1 بیاموزیم.
بیان SID2 , EDS5 / SID1 درجهش یافته هایی که از نظر ساختاری سطوح بالایی از اسید سالیسیلیک را بیان می کنند (مانند جهش یافته های cpr) و یا آنهایی که در تنظیم SAR نقش دارند (مانندnim1 / npr1 , Ndr1 , pad4, eds1) ژن ICS1 را در مسیر تبدیل پیام برای SAR وابسته به اسید سالیسیلیک قرار می دهند. (شکل 2).
نتیجه گیری:
نیاز است که نقش و ارتباط اسید سالیسیلیک مشتق شده از اسید سینامیک در LAR و SAR در پرتو موضوع اسید سالیسیلیک تولید شده از isochorismate دراثر عوامل بیماری زا مورد بررسی مجدد قرار گیرد. اهمیت مسیر isochorismate نباید تنها منحصر به Arabidopsis باشد، چرا که ICS در گیاهان متعلق به خانواده های مختلف وجود دارد [9].
اگر مسیرهای اسید سینامیک و isochorismate همانند هم عمل می کنند، باید هر یک از این مسیرها توسط محرک ویژه ای تحریک گردند. نتایج به دست آمده از جهش یافته های Arabidopsis sid2 از این فرضیه پشتیبانی نمی کند، زیرا تجمع اسید سالیسیلیک پس از محدود شدن محرک ها مانند عوامل بیماری زای زنده یا غیر زنده، تنش اُزُن و یا تشکیل کالوس متوقف شده است در عوض، مسیر اسید سینامیک تنها باید در تولید سطوح ابتدایی اسید سالیسیلیک که در گیاهان غیر آلوده وجود دارد، مشارکت داشته باشد. گذشته از اسید سینامیک، منبع دیگری از سطوح ابتدایی اسید سالیسیلیک که از فعالیت ژن ثانویه ی ICS (ICS2) حاصل می شود، پیشنهاد شده است؛ نسخه هایی که تاکنون در برگ های آلوده شده یا آلوده نشده ی Arabidopsis غیر قابل تشخیص باقی مانده اند [9].
چندین گزارش که به طور عمده بر مطالعات radio Labeling (رادیو بر چسب ها) و بازدارنده ها استوار بوده اند، شواهدی را از افزایش اسید سالیسیلیک مشتق شده از اسید سینامیک در اثر تحریک عوامل بیماری زا به دست داده اند [2]. در حال حاضر مشارکت ویژه ی اسید سالیسیلیک مشتق شده از اسید سینامیک در ایجاد SAR از درک ما خارج است، زیرا شواهد به دست آمده از Arabidopsis نشان می دهد که منبع عمده ی اسید سالیسیلیک از ژن ICS حاصل می شود [9].
برای روشن شدن نحوه ی عملکرد و تنظیم اسید سالیسیلیک مشتق شده از اسید سینامیک و یا چرخه ی Isochorismates به آزمایشات بیشتری نیاز است.
به طور خلاصه این نکات برجسته پیرامون بیوسنتز اسید سالیسیلیک، امکان ارتقاء ابزار جدید برای درک بهتر اساس ملکولی تنظیم بیوسنتز اسید سالیسیلیک را فراهم می کند.
شکل 1- مسیر های بیوسنتزی تولید اسید سالیسیلیک. بخش هایی که با رنگ آبی مشخص شده، در ابتدا در باکتری های تشریح شده است و اکنون ثابت شده است که در کلروپلاست گیاهان نیز وجود دارد.
مخفف ها: ICS : آنزیم ایزوکوریسمیت سینتاز.
اجزای پروتئینی به اختصار چنین است:
CPR ، بیان کننده ی ساختاری PR1.
EPS، افزایش تحمل به بیماری ها.
PAD4، نقص فیتو آلکسین.
NDR، مقاومت ویژه ی غیر تخریبی.
NIM، ایمنی غیر تحریکی.
NPR، عواملی که ژن PR را بیان نمی کنند.
SID ، نقص تحریک اسید سالیسیلیک .
نویسنده:ز رحمانپور
